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雙光子顯微成像用飛秒鐳射器

時間│·☁:2022-02-28 點選次數│·☁:931

雙光子顯微成像用飛秒鐳射器

雙光子激發熒光(TPEF)顯微鏡◕↟,也稱為雙光子顯微鏡◕↟,是對活體組織深層三維成像的法•••。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優勢◕↟,它使用了更長的激發波長(通常是近紅外波段)◕↟,因而其帶來的散射比傳統共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見波長更少•••。更長的波長同時也減少了來自散射光的背景照明◕↟,並增加了在更高深度處的對比度•••。目前◕↟,用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內大腦影象•••。


在熒光顯微鏡中◕↟,當兩個獨立的光子被一種介質同時吸收時◕↟,就會發生雙光子激發•••。這需要兩個合適能量的光子在這樣的介質上時間和空間上同時重合;通常來說這不需要非常大的激發光子通量◕↟,當然光子通量越大◕↟, 雙光子同時被吸收的機率就越大•••。在TPEF顯微鏡中◕↟,更高的光子通量會帶來更高的效率◕↟,從而帶來影象質量和解析度的提升•••。


在TPEF顯微鏡中◕↟,雙光子激發所需的大光子通量更多的是透過寬波段可調諧的鈦寶石飛秒鐳射器實現的◕↟,鐳射器典型規格脈寬為100fs◕↟,重複頻率約為80MHz◕↟,這可以給雙光子顯微鏡帶來非常高的峰值功率和大光子通量•••。然而◕↟,鐳射器較高的平均功率(在1~4瓦範圍內)會由於激發波長的線性吸收引起的與介質的光熱相互作用而造成熱損傷•••。這種效應在體內成像中尤其重要◕↟,因為溫度超過40ºC會導致不可逆的損傷•••。因此◕↟,傳統的固態鐳射器所提供的平均功率必須被衰減才能實際應用於TPEF顯微鏡◕↟,峰值功率也會相應地降低•••。保持較低的平均功率以避免熱損傷◕↟,同時縮短脈衝持續時間是一種替代的提高峰值功率的方法•••。這減少了光子落在介質上的時間間隔◕↟,同時提高了介質被吸收的機率•••。


近日◕↟,西班牙FYLA公司利用先進超連續譜全光纖鐳射器技術得到脈衝寬度短至15fs的商業鐳射器◕↟,命名型號“SCH"•••。與傳統的100fs鐳射器相比◕↟,SCH的15fs脈衝寬度可在相同平均功率水平下提供超過傳統飛秒鐳射器7倍的光子通量•••。


圖1│·☁:FCH 寬光譜光纖飛秒鐳射器◕↟,波長範圍950-115nm◕↟,脈衝寬度15fs, 峰值功率>200kW


圖2│·☁:藍色線│·☁:SCH 飛秒鐳射器光譜曲線;橙色線│·☁:1um波段百秒鐳射器光譜曲線;灰色線│·☁:紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜


但是◕↟,巨幅提高每個時間和麵積上可用光子數量對影象的真正影響是什麼呢·☁◕?

一•·、更高的激發效率◕↟,更高的影象亮度

理論上◕↟,在雙光子顯微鏡中◕↟,影象的亮度與激發效率直接相關◕↟,而激發效率*依賴於光子通量和熒光團的二階非線性激發截面(GM) •••。作為一個例子◕↟,我們可以嘗試計算熒光蛋白mRFP在15fs鐳射脈寬(如SCH飛秒鐳射器)和1050nm中波長照射下的激發效率•••。與100fs的鐳射器相比◕↟,15fs鐳射器具有更寬的頻寬(達200nm)◕↟,可以在900到1200nm之間激發mRFP◕↟,與100fs鐳射器的11nm相比◕↟,這是一個更寬的光譜區域•••。


圖3│·☁:藍色曲線│·☁:以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖鐳射器的峰值功率; 橙色曲線│·☁:以1050nm為中心的100fs光纖飛秒鐳射器的峰值功率;黑色曲線│·☁:mRFP的二階非線性激勵截面(GM)


考慮到各波長的峰值功率和激發截面◕↟,可以計算出mRFP的激發效率•••。結果表明◕↟,與傳統100fs鐳射器相比較◕↟,SCH飛秒鐳射器15fs的脈衝寬度使得激發效率提高了50%•••。


圖4│·☁:藍色曲線│·☁:SCH 15fs全光纖飛秒光纖鐳射器的峰值功率; 橙色曲線│·☁:100fs光纖飛秒鐳射器的峰值功率;黑色曲線│·☁:mRFP的二階非線性激勵截面(GM)


圖5│·☁:小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡影象◕↟,用SYTOX Green標記細胞核(黃色)和Alexa Fluor 568煥鈦標記肌動蛋白絲(藍色)


二•·、多色同時激發

想象一下◕↟,同時成像多個波段範圍的熒光團◕↟,而不必考慮選擇最佳激發波長的鐳射器•••。在雙光子顯微鏡中◕↟,使用傳統的100fs激發鐳射器◕↟,這通常是一個複雜的◕↟,有時甚至是不可能完成的任務•••。傅立葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒鐳射器(例如鈦寶石飛秒鐳射器•·、920nm光纖飛秒鐳射器)的光譜寬度通常在10~20nm範圍內◕↟,它們只能同時激發激發光譜在10~20nm光譜範圍內的熒光團•••。因此◕↟,若想用單臺鐳射器去同時激發更多種類的熒光團就需要頻寬更寬◕↟,脈衝更短的鐳射器•••。


SCH寬光譜飛秒鐳射器在提供15fs脈衝寬度的同時以1050nm為中心波長提供200nm的頻寬◕↟,在這個頻寬範圍內 (橫跨900到1200nm)的所有綠色和紅色的熒光團都可以同時被這種鐳射器激發•••。這對於雙光子顯微鏡來說◕↟,同時對多個熒光團成像成為一個可行的◕↟,實用的和簡單的替代•••。



圖5│·☁:常見熒光探針激發波長

圖6│·☁:小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡影象


用Sytox Green標記細胞核(洋紅色)◕↟,FITC濾波器;用Alexa Fluor 568 Phaloidin標記肌動蛋白絲(綠色)◕↟,TRITC過濾器•••。兩種熒游標記物同時被SCH鐳射器激發◕↟,用尼康的熒光濾片組過濾熒光•••。

Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.


綜上所述◕↟,FYLA公司推出的新型•·、緊湊而強大的SCH全光纖飛秒鐳射器鐳射器◕↟,提供15fs的脈衝持續時間和高峰值功率(>200kW)◕↟,為體內樣本的低光損傷激發提供了強大的工具•••。結合全光纖鐳射器的緊湊性和堅固性性◕↟,SCH飛秒鐳射器成為雙光子顯微鏡的特殊鐳射選擇•••。


現在◕↟,FYLA公司推出SCH飛秒鐳射器的免費測試服務◕↟,包括運輸和安裝◕↟,無需承諾購買◕↟,此外對已購買的客戶提供全面免費2年質保優惠政策◕↟,如果您對SCH鐳射器感興趣並有意測試使用◕↟,請聯絡上海昊量光電裝置有限公司•••。


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