科普-超分辨顯微成像之多波長合束鐳射器

曾經有這樣一個傳言││☁▩，“中國的*長城是太空中能看到的地球上的人工建築”││☁▩，這讓我們中國人自豪無比│▩。但神舟載人飛船上天后││☁▩，包括楊利偉◕·、劉洋在內的眾多航天員都曾說過││☁▩，“沒有看到長城”││☁▩，這是為何呢☁·₪◕？

長城

其實人眼的解析度很有限││☁▩，只有0.3角分左右││☁▩，即便在二百公里左右的近地點軌道高度上││☁▩，不考慮任何天氣因素││☁▩，人眼至多看清17米以上的目標││☁▩，因此對於寬度不過七八米的長城││☁▩，確實有心無力了│▩。當然了││☁▩，若是不考慮“看清”││☁▩，而只是“看到”││☁▩，那麼只要在夜間將長城照的燈火通明││☁▩，太空中的宇航員就有可能“看到”長城了│▩。不過這就像遠遠看到商店的霓虹燈箱││☁▩，卻看不清楚燈箱的字一樣││☁▩，不屬於我們此處討論的範疇│▩。

200公里左右太空看長城效果示意圖

成像系統的解析度之所以會受到限制││☁▩，除了光學元件存在像差之外││☁▩，更重要的原因是光波存在衍射效應││☁▩，使得一個理想無限小的點物體發射的光波透過系統成像後││☁▩，由於成像系統口徑有限││☁▩，物體光的高頻成分被阻擋││☁▩，終參與成像的只有物體光波的低頻成分（因此傳統成像系統本質上相當於一個低通濾波器）││☁▩，使得終的像不再是一個無限小的理想點││☁▩，而成為了一個彌散的亮斑││☁▩，稱為“艾裡斑”│▩。
 

因此當兩個點物體距離較近時││☁▩，它們透過成像系統後形成的兩個艾裡斑就會重疊到一起無法分辨││☁▩，兩個物點恰能分辨的距離就是極限分辨距離││☁▩，對應的張角即為極限分辨角││☁▩，這就是的“瑞利判據”│▩。科學家發現││☁▩，通常情況下該極限解析度與光的波長（λ）◕·、成像系統口徑（D）和數值孔徑（NA）等引數有關│▩。

瑞利判據

為了獲得更好的成像效果││☁▩，科學家嘗試了許許多多的方法☁╃：在光刻系統中使用越來越短的光波（如目前因特爾等晶片企業已開始使用極紫外光）││☁▩，擴大成像系統口徑（如天文望遠鏡口徑已達到10米以上）││☁▩，增加成像系統數值孔徑（如顯微成像系統使用浸油等方式獲得更大的NA）等││☁▩，但這些方法都未能擺脫理論極限的影響│▩。
 

“衍射極限”彷彿是一片籠罩在頭頂的陰霾││☁▩，成為了看似堅不可摧的障礙│▩。為了能夠打破這個枷鎖和桎梏││☁▩，實現超分辨成像││☁▩，科學家們真是腦洞大開││☁▩，展現出了無窮的智慧│▩。

讓我們看看科學家們透過哪些方法打破桎梏☁╃：
結構光照明顯微(SIM)
普通光學顯微鏡的成像過程可以透過點擴充套件函式進行描述││☁▩，透過對點擴充套件函式進行傅立葉變換││☁▩，可獲得顯微系統的光學傳遞函式│▩。由於衍射極限的存在││☁▩，光學傳遞函式限制了透過顯微系統的資訊量││☁▩，只允許低頻資訊透過系統││☁▩，濾除代表細節的高頻資訊││☁▩，即限制了系統的解析度│▩。
 

結構光照明顯微鏡實現超分辨的原理││☁▩，就是利用特定結構的照明光 在成像過程把位於光學傳遞函式範圍外的一部分資訊轉移到範圍內││☁▩，利用特定演算法將範圍內的高頻資訊移動到原始位置││☁▩，從而擴充套件透過顯微系統的樣品頻域資訊││☁▩，使得重構影象的解析度超越衍射極限的限制│▩。
 

對於光學顯微鏡系統││☁▩，光學傳遞函式的三維結構是圓環結構││☁▩，在零頻位置存在凹陷│▩。凹陷帶來的後果就是CCD 上記錄的資訊不僅包含物鏡焦平面上的樣品資訊││☁▩，同時包含焦平面外的樣品資訊│▩。由於受到焦平面外的資訊的干擾││☁▩，常規熒光顯微鏡無法獲得層析影象│▩。三維結構光照明顯微鏡提高解析度◕·、獲得層析影象的原理││☁▩，就是利用特定結構的照明光來獲得樣品的高頻資訊││☁▩，採用特定演算法在橫向和縱向上擴充套件樣品頻域資訊的同時彌補凹陷帶來的影響│▩。

飽和結構照明顯微鏡(SSIM)的原理

法國OXXIUS多波長合束鐳射器應用在Nikon顯微鏡

受激發射損耗顯微（STED）

在STED顯微術中││☁▩，有效熒光發光面積的減小是透過受激發射效應來實現的│▩。一個典型的STED顯微系統中需要兩束照明光││☁▩，其中一束為激發光││☁▩，另外一束為損耗光│▩。當激發光的照射使得其衍射斑範圍內的熒光分子被激發││☁▩，其中的 電子躍遷到激發態後││☁▩，損耗光使得部分處於激發光斑外圍的電子以受激發射的方式回到基態││☁▩，其餘位於激發光斑中心的被激發電子則不受損耗光的影響││☁▩，繼續以自發熒光的方式回到基態│▩。

由於在受激發射過程中所發出的熒光和自發熒光的波長及傳播方向均不同││☁▩，因此真正被探測器所接受到的光子均是由位於激發光斑中心部分的熒光樣品透過自發熒光方式產生的│▩。由此││☁▩，有效熒光的發光面積得以減小││☁▩，從而提高了系統的解析度│▩。STED顯微術能實現超分辨的另一個關鍵在於受激發射與自發熒光相互競爭中的非線性效應│▩。

當損耗光照射在激發光斑的邊緣位置使得該處樣品中的電子發生受激發射作用時││☁▩，部分電子不可避免地仍然會以自發熒光的方式回到基態│▩。然而當損耗光的強度超過某一閾值之後││☁▩，受激發射過程將出現飽和││☁▩，此時以受激發射方式回到基態的電子將佔絕大多數││☁▩，而以自發熒光方式回到基態的電子則可以忽略不計│▩。因此││☁▩，透過增大損耗光的強度││☁▩，使得激發光斑範圍內更多範圍的自發熒光被抑制││☁▩，可以提高STED顯微術的解析度│▩。

受激發射損耗(STED)顯微的原理

法國OXXIUS公司多波長合束鐳射器

STORM和PALM超分辨顯微成像技術

STORM技術中││☁▩，使用Cy3和Cy5分子對作為熒游標記實現超分辨成像││☁▩，因為不同波長光可以控制Cy5在熒光激發態和暗態之間切換││☁▩，例如紅色633nm鐳射可以啟用Cy5發射熒光││☁▩，同時長時間照射可以將Cy5分子轉換成暗態不發光│▩。之後用綠色的532nm鐳射照射Cy5分子時││☁▩，可以將其從暗態轉換成熒光態││☁▩，而此過程的長短依賴於第二個熒光分子Cy3和Cy5之間的距離││☁▩，因此││☁▩，當Cy3和Cy5交聯成分子對時││☁▩，具備了特定的激發光轉換熒光分子發射波長的特性│▩。

在顯微觀察前││☁▩，首先將待測觀察樣品用染劑染色││☁▩，將Cy3和Cy5分子對膠聯到特異的蛋白質抗體上││☁▩，就可以用抗體來標記細胞的內源蛋白││☁▩，然後用波長為633nm的紅光長時間照射樣品使Cy5發射熒光後全部轉化為暗態││☁▩，採用波長為532nm的綠光激發Cy3││☁▩，從而使Cy5處於熒光態│▩。激發過程中應使532nm綠光強度足夠低││☁▩，以保證在衍射極限範圍內至多隻有一個Cy5熒光分子被啟用至熒光態│▩。而後││☁▩，用波長為633nm的紅色鐳射照射待觀察樣品││☁▩，使處於熒光態的Cy5分子發射熒光│▩。透過電子相機讀取熒光影象││☁▩，採用函式擬合的方法對影象進行處理││☁▩，進而確定每個熒光點的中心位置│▩。經過足夠多次數迴圈後對獲得的熒光點位置進行疊加││☁▩，終得到超分辨顯微影象│▩。

STORM技術中熒光開關原理圖

PALM技術中││☁▩，使用GFP突變體作為光活化蛋白（PA-GFP）來標記靶蛋白││☁▩，並在細胞中表達│▩。用405nm鐳射器低能量照射細胞表面││☁▩，一次僅激活出稀疏分佈的幾個熒光分子││☁▩，然後用561nm鐳射激發得到熒光││☁▩，透過高斯擬合來定位這些熒光分子││☁▩，在確定這些分子的位置後││☁▩，長時間使用561nm鐳射來漂白這些已經定位正確的熒光分子後││☁▩，使他們不能夠被下一輪的鐳射再激活出來│▩。

再分別用405nm和561nm鐳射來啟用◕·、激發和漂白其他熒光分子││☁▩，多次成像後││☁▩，將這些分子的熒光影象合成到一張圖上││☁▩，得到了比傳統光學顯微鏡至少高10倍以上的解析度│▩。PALM顯微鏡的解析度僅僅受限於單分子成像的定位精度││☁▩，理論上來說可以達到1nm的數量級│▩。PALM的成像方法只能用來觀察外源表達的蛋白質││☁▩，而對於分辨細胞內源蛋白質的定位無能為力│▩。

STROM與PALM的基本原理一致││☁▩，區別在於STORM使用的熒光開關基團是有機熒光分子對││☁▩，而PALM使用的熒光開關基團是熒光蛋白分子││☁▩，由於STORM具有對細胞內源性生物分子成像的優勢││☁▩，目前STORM在活細胞等生物體系的應用更加廣泛│▩。在空間解析度上││☁▩，STORM可以達到10-20nm││☁▩，PALM可以達到20-30nm；在時間解析度上││☁▩，STORM可以達到1s││☁▩，而PALM約為30s│▩。

STORM與常規顯微成像方法對細胞內微管成像效果對比
 

什麼是多波長合束鐳射器☁·₪◕？

合束鐳射器就是將多個波長光合束到一起輸出││☁▩，它把合束/分束◕·、透鏡◕·、整形器件等全部整合並做了穩固性的設計││☁▩，各波長獨立控制│▩。可以讓科研工作者或工程師們專心於試驗部分而不是做複雜的光路調節

傳統合束光路

OXXIUS合束鐳射器內部光路設計

OXXIUS合束鐳射器都有啥乾貨☁·₪◕？

多8波長輸出~緊湊合理的尺寸~高穩定輸出功率~高光束質量~高速調製功能~強大智慧性….
L4Cc是一款緊湊型多波長合束鐳射器（通用型鐳射引擎）││☁▩，它可將8個不同波長的鐳射耦合到一根單模或保偏光纖之中輸出││☁▩，能同時或單獨對每一路鐳射進行控制││☁▩，單波長功率可達300mW│▩。此外OXXIUS可根據客戶不同的要求進行量身定製化的服務│▩。同時我們具有遠端診斷修復和自我保護功能││☁▩，同時具有透過USB和RS232介面進行軟體控制│▩。鐳射器可進行高速模擬調製或TTL調製│▩。

產品特點☁╃：
客戶可以自由選擇合束鐳射的數量（2個到 8個波長可選）
自由空間光輸出/各種光纖耦合輸出可選；
單光路或多光路輸出
智慧性強（遠端診斷修復和自我保護功能）；
軟體控制（透過USB和RS232介面）
高穩定性││☁▩，光束質量高││☁▩，噪聲低；
百MHZ的TTL調製功能和模擬調製；
結構緊湊││☁▩，堅固耐用；
可根據客戶的要求定製││☁▩，不收取定製費；
高性價比;

主要應用☁╃：超解析度成像◕·、共聚焦顯微鏡◕·、熒光激發◕·、流式細胞儀◕·、SPIM◕·、FRAP◕·、TIRF……
 

典型波長引數☁╃：

OXXIUS合束鐳射器家族部分解決方案☁╃：

（單光路輸出）                                      （雙光路輸出）

（8波長四光路輸出）                       （6波長可插拔光纖輸出）

OXXIUS公司其它鐳射器: